Introducere la principiul și aplicarea componentelor generale ale spectrofotometrului

Spectrofotometrul este utilizat pe scară largă în cercetarea biologică, chimică, clinică și de mediu.
Spectrofotometria măsoară câtă lumină poate absorbi o substanță chimică trecând un fascicul de lumină printr-o probă dintr-un spectrofotometru.
Măsurând intensitatea luminii detectate, metoda poate fi utilizată pentru a determina concentrația de solut din probă.
Conceptul de spectrofotometrie
Fasciculul trimis la eșantion este format dintr-un fascicul de fotoni.
Când fotonii întâlnesc moleculele din eșantion, moleculele pot absorbi unele dintre ele, reduce numărul de fotoni din fascicul și reduce intensitatea semnalului de detecție.
Transmitența face parte din lumina care trece prin eșantion. Este definit ca intensitatea luminii care trece prin eșantion la intensitatea luminii incidente.
Absorbanța este opusă transmisiei, corespunzând cantității măsurate de spectrofotometru.
Conform absorbanței, concentrația probei de soluție poate fi determinată din proiectul de lege Lambert, care arată că există o relație liniară între absorbanță și concentrația probei. Conform legii Lambert a berii, absorbția este produsul coeficientului de absorbție, care este o măsură a cantității de lumină absorbită de solut la o lungime de undă dată și a distanței prin care trece lumina. Proba sau distanța de deplasare și concentrația de solut. În general, scopul măsurării absorbanței este măsurarea concentrației probei.
Componentele spectrofotometrului
Fiecare spectrofotometru este format dintr-o sursă de lumină, un colimator (lentilă sau un dispozitiv de focalizare pentru a transmite fascicule puternice și drepte), un monocromator pentru separarea fasciculelor de diferite lungimi de undă și un selector de lungime pentru selectarea undei sau a canelurii lungimii de undă dorite. Lungimea de undă a luminii utilizate în spectrofotometrul prezentat în acest videoclip este în gama luminii ultraviolete și vizibile. Spectrofotometrul include, de asemenea, un suport pentru eșantion, un fotodetector și un ecran care afișează rezultatele detectorului.
Cel mai recent spectrofotometru este cuplat direct la un computer, unde parametrii experimentali pot fi controlați și rezultatele afișate.
Principiul de lucru al spectrofotometrului
Atunci când efectuați spectrofotometria, este important să luați măsurile de precauție adecvate, cum ar fi purtarea de mănuși, în funcție de tipul de soluție biologică sau chimică pe care o utilizați.
Porniți dispozitivul și lăsați lampa și electronica să se încălzească înainte de a măsura spectrul UV-Vis al eșantionului.
Pregătiți o probă goală a aceleiași soluții cu același pH și aceeași rezistență ionică, dar fără a fi analizate componentele; întrucât cuva și solventul pot dispersa lumina, este necesară analiza probei.
Suportul de probă tradițional pentru spectrofotometru este proiectat să țină boluri de plastic și cuarț. Pipetați soluția originală într-un bol.
După ștergerea oricărei amprente și stropirea lor pe exteriorul vasului, introduceți cuva corect în suportul probei și închideți ușa capacului.
Nu uitați niciodată să închideți ușa, deoarece radiațiile UV de la un spectrofotometru deschis vă pot deteriora ochii și pielea.
Programează lungimea de undă sau intervalul de lungime de undă care vor fi transmise eșantionului. Aceasta depinde de cea mai bună lungime de undă pe care o poate absorbi componenta analizată. Apoi, aparatul este zero prin măsurarea probei goale, care scade absorbția inferioară datorită tamponului de probă.
În funcție de tipul de experiment cu spectrofotometrie pe care îl efectuați, poate fi necesară generarea unei curbe standard înainte de măsurarea eșantionului, din care poate fi determinată concentrația compusului analizat în probă.
Lăsați eșantionul să atingă temperatura adecvată și amestecați ușor pentru a evita introducerea de bule. Eșantionul poate fi apoi adăugat direct în vasul din interiorul mașinii și se poate face o citire.
După ce proba a fost măsurată pentru absorbție, experimentul este calculat corespunzător; de exemplu, pentru a determina concentrația sau nivelul activității enzimelor.
Aplicarea spectrofotometrului
Una dintre utilizările comune ale spectrofotometrului este măsurarea densității celulare. Măsurarea densității celulare poate fi utilizată pentru a produce curba logaritmică de creștere a bacteriilor, din care poate fi determinat timpul optim pentru integrarea proteinei recombinante.
Spectrofotometrul poate fi, de asemenea, utilizat pentru a măsura rata de reacție chimică. În această realizare, absorbanța este utilizată pentru a monitoriza reacția enzimatică, care dispare cu timpul printr-o reacție intermediară de 452nm. Rata acestei etape enzimatice poate fi calculată prin potrivirea datelor cu ecuația corespunzătoare.
Introducerea micro-spectrofotometru elimină nevoia de suport pentru probă. Aceste spectrofotometre folosesc tensiunea superficială pentru a menține proba.
Microspectrofotometrul este cea mai bună alegere pentru a măsura masa și concentrația probelor mici și scumpe, cum ar fi biomoleculele, inclusiv proteinele și acizii nucleici.
Absorbanța proteinelor la 280 nm depinde de conținutul lanțurilor laterale aromatice găsite în triptofan, tirozină și fenilalanină, precum și legătura disulfură dintre cele două cisteine.
Concentrația proteinei poate fi determinată de absorbția sa la 280 nm și de coeficientul său de absorbție, care se bazează pe compoziția aminoacizilor.
ADN-ul și ARN au absorbția maximă la 260 nm, din care concentrațiile lor pot fi determinate. Puritatea acizilor nucleici poate fi, de asemenea, evaluată din raportul dintre citirile de absorbție și lungimile de undă specifice.