Cuantificarea acizilor nucleici în spectrofotometre
Cuantificarea acizilor nucleici este cea mai frecvent utilizată funcție a unui spectrofotometru. Oligonucleotidele, ADN-ul monocatenar, dublu catenar și ARN pot fi cuantificate în tampoane. Maximul de absorbție al maximului maxim de absorbție al acidului nucleic este de 260 nm. Fiecare acid nucleic are o compoziție moleculară diferită și prin urmare are factori de conversie diferiți. Pentru a cuantifica diferite tipuri de acizi nucleici, selectați în prealabil coeficienții corespunzători. De exemplu, absorbția lui 1OD este echivalentă cu 50 pg / ml dsDNA, 37 pg / ml ssDNA, 40 ug / ml ARN și, respectiv, 30 ug / ml Olig. Valoarea absorbanței după test este convertită prin coeficientul de mai sus pentru a obține concentrația corespunzătoare a probei. Înainte de testare, selectați procedura corectă, introduceți volumele soluției stoc și diluant și testați soluțiile goale și probă. Cu toate acestea, experimentul nu a fost ușor. Citirile instabile pot fi cea mai mare durere de cap pentru experienti. Cu cât este mai mare sensibilitatea instrumentului, cu atât deviația absorbției este mai mare.
De fapt, principiul de proiectare și principiul de funcționare al spectrofotometrului permit modificarea valorii absorbanței într-un anumit interval, adică instrumentul are un anumit grad de acuratețe și acuratețe. Cum ar fi precizia biophotometrului Eppendorf ≤ 1,0% (1A). Rezultatele acestor teste multiple variază între media de 1,0% și toate sunt normale. În plus, trebuie luate în considerare și proprietățile fizico-chimice ale acidului nucleic, pH-ul tamponului pentru dizolvarea acidului nucleic, concentrația de ioni etc. În timpul testului, o concentrație de ioni prea ridicată va determina citirea drift ca TE, care va stabiliza foarte mult lectura. Concentrația diluată a probei este, de asemenea, un factor care nu este neglijabil: datorită prezenței inevitabile a particulelor mici în probă, în special a probelor de acid nucleic. Prezența acestor particule mici interferează cu efectul de testare. Pentru a minimiza influența particulelor asupra rezultatelor testului, absorbția acidului nucleic trebuie să fie de cel puțin 0,1 A și absorbția este de preferință 0,1-1,5 A. În acest interval, nu trebuie să existe bule în amestec și nu există suspensie în martor. În caz contrar, citirile devin violente; aceeași pahar colorimetric trebuie utilizat pentru a testa martorul și proba; altfel, diferența de concentrație este prea mare; coeficientul de conversie și unitatea de concentrare a probei sunt aceleași; Cuva purtată de fereastră; volumul eșantionului trebuie să atingă mai mult decât volumul minim necesar al paharului de culoare etc.
În plus față de concentrația de acid nucleic, spectrofotometrul prezintă mai multe rapoarte foarte importante simultan pentru a indica puritatea probei, cum ar fi raportul A260 / A280, în scopul evaluării purității probei, deoarece picul de absorbție al proteinei este de 280 nm. Probele pure au un raport mai mare de 1,8 (ADN) sau 2,0 (ARN). Dacă raportul este mai mic de 1,8 sau 2,0, acesta indică prezența substanțelor proteice sau fenolice. A230 indică faptul că în eșantion există unii contaminanți, cum ar fi carbohidrații, peptidele, fenolii etc. Raportul dintre acidul nucleic pur A260 / A230 este mai mare de 2,0. A320 detectează turbiditatea soluției și alți factori de interferență. Eșantionul pur, A320 este, în general, 0.
Compania este specializată în vânzarea de spectrofotometri , clienți de bun venit care au nevoie de consultanță și de cumpărare, vă vom oferi servicii sincere și produse de calitate, precum și prețuri mai mici.
E-mail: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com